答:a.?洗脫時(shí)間不足;?
b.?增大Elution?Buffer的洗脫體積;
c.?加大Elution?Buffer中還原型谷胱甘肽的濃度。谷胱甘肽的推薦濃度是10?mM,若此濃度洗脫效果不是很理想可以嘗試50?mM?Tris-?HCl,?20–40?mM?reduced?glutathione,?pH?8.0?的Elution?Buffer;
d.?增大Elution?Buffer的pH值。Elution?Buffer的pH值調(diào)至pH?8–9可以提高洗脫效率而不需要增加glutathione的濃度;
e.?增加Elution?Buffer的離子強(qiáng)度。加入0.1–0.2?M?NaCl能提高洗脫效率;
f.?改用新鮮配置的Elution?Buffer;?
g.?Elution?Buffer中加入非離子型變性劑。非特異性的疏水作用可能會(huì)阻礙GST融合蛋白從磁珠上增溶和洗脫。加入0.1%?Triton?X-100?or?2%?和N-octylglucoside可以顯著增加洗脫效率。
答:a.?超聲太劇烈或時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)引起蛋白變性,導(dǎo)致蛋白不能與磁珠結(jié)合。需注意設(shè)置好超聲儀的功率和間隔時(shí)間;?
b.?在細(xì)胞裂解和加Binding?Buffer和Elution?Buffer之前,加入終濃度1–10?mM?DTT可以顯著提高GST融合蛋白的結(jié)合效率;
c.?由于pH值低于6.5或高于8.0結(jié)合效率會(huì)降低,因此使用前需用pH6.5~8.0的Buffer如PBS進(jìn)行平衡;?
d.?如果磁珠已經(jīng)使用過幾次,有必要進(jìn)行重生或者改用新磁珠。
答:試劑盒中緩沖液的成分都是保密的??梢圆捎靡韵碌木彌_液進(jìn)行替換
結(jié)合緩沖液:PBST
(150mM PBS,150mM NaCl,0.1% (v/v) Tween-20,pH7.2);
洗脫緩沖液:甘氨酸緩沖液
(0.1M Glycine,0.1% (v/v) Tween-20,pH2.5);
保存緩沖液:
(50mM Tris-HCl,0.1%(v/v) Tween-20,0.01%(w/v) NaN3,pH7.5);
洗滌緩沖液:
(50mM Tris-HCl,0.1%(v/v) Tween-20,pH7.5);
再生緩沖液:
(1% (v/v) TritonX-100,PBS);
中和緩沖液 :( 1M Tris-HCl,pH9.0)。
答:木瓜蛋白酶是一種蛋白水解酶,目前對(duì)protein A/G的影響未知,建議客戶慎用。
答:由于疏水性蛋白黏附在磁珠上導(dǎo)致磁珠黏壁。建議緩沖液中加入0.05% tween-20。如果不能改善,不建議繼續(xù)重復(fù)使用。
答:磁珠適宜的pH值范圍為pH3-11。
答:純化不同種類的蛋白時(shí),建議使用新的磁珠。
答:一般使用3次后需要再生,多次重復(fù)使用會(huì)降低純化效率約50%。
答:可以重復(fù)再生,我們測(cè)試過重復(fù)再生六次,純化效果沒有變化。
答:IDA-鎳的蛋白載量高,40mg/mL Gel,純度稍低,90%。
IDA-鈷的蛋白載量稍低,25mg/mL Gel,純度95%。
一般客戶建議購(gòu)買IDA-鎳磁珠,即可達(dá)到目的。
答:結(jié)合緩沖液中低濃度的咪唑是為了減少雜蛋白的非特異性吸附;
洗滌緩沖液中低濃度咪唑是為了吸取吸附能力較弱的雜蛋白;
洗脫液中高濃度咪唑是為了洗脫目的蛋白。
答:①再生過程的堿處理可以改善再生磁珠的蛋白純化效果,參考說明書中磁珠再生部分步驟4。
②重新掛金屬離子后為清洗干凈,需要增加洗滌步驟。殘留的金屬離子優(yōu)先跟蛋白結(jié)合,影響蛋白與磁珠的結(jié)合。
答:穿透組分中目標(biāo)蛋白明顯減少,而洗脫組分中目標(biāo)蛋白很少,取少量磁珠加SDS-PAGE Loadding Buffer于95℃加熱5~10min,離心跑電泳,如果發(fā)現(xiàn)較多蛋白殘留。
(1)洗脫調(diào)節(jié)太溫和。提高洗脫液咪唑濃度至700mM還不能洗脫時(shí),可以嘗試降低洗脫液pH至4.0,但低pH會(huì)也導(dǎo)致金屬離子脫落,磁珠需要再生后再使用。
(2)蛋白吸附在磁珠上無法洗脫。對(duì)于非特異性疏水吸附的蛋白,可以增加NaCl濃度至1M,或添加0.1%~2%的Triton X-100。對(duì)于聚集沉淀在磁珠上的(尤其注意含有二硫鍵的蛋白),可以在洗脫緩沖液中加入6M鹽酸胍進(jìn)行變性洗脫。
答:(1)雜蛋白吸附。由于組氨酸,色氨酸,半胱氨酸等是蛋白質(zhì)中很常見基團(tuán),而蛋白折疊可能導(dǎo)致幾個(gè)這樣的氨基酸殘基臨近,這樣也會(huì)使它們和磁珠的作用力增加??梢杂貌煌瑵舛鹊倪溥蜻M(jìn)行梯度洗脫,在樣品及平衡緩沖液中添加0.5%吐溫或Triton X-100,或5~50%的甘油,可以避免因?yàn)槭杷嗷プ饔脤?dǎo)致非特異吸附,或使用鈷離子螯合磁珠(BeaverbeadsTM IDA-Cobalt)。此外,要獲得純度較高的蛋白,需要對(duì)裂解、結(jié)合緩沖液、洗滌緩沖液、洗脫緩沖液的組分、pH、咪唑濃度等進(jìn)行優(yōu)化。若還是不能獲得高純度的蛋白,則需要考慮使用多步純化,結(jié)合使用離子交換、凝聚過濾等純化方法;
(2)菌體破碎條件太劇烈導(dǎo)致蛋白斷裂。確保在冰浴條件下破碎;降低超聲破碎的強(qiáng)度,縮短時(shí)間;適當(dāng)稀釋樣品,添加核酸酶,降低樣品粘稠度;
(3)蛋白被部分水解:添加合適的蛋白酶抑制劑,并盡可能在低溫下操作。
答:(1)磁珠用量不足。本產(chǎn)品磁珠懸液濃度為10%,對(duì)于親和力較高的蛋白,每毫升磁珠懸液可結(jié)合的蛋白量約為3~4mg。用戶需要根據(jù)目標(biāo)蛋白含量,使用足夠量的磁珠。對(duì)于親和力較低的蛋白,需要增加磁珠用量,延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間,或提高樣品及結(jié)合緩沖液pH;
(2)蛋白與磁珠親和力較低。參考問題1;
(3)蛋白濃度低。對(duì)樣品進(jìn)行濃縮,或增加磁珠用量、延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間;
(4)磁珠重復(fù)使用次數(shù)太多。將磁珠進(jìn)行再生處理(參考產(chǎn)品說明書)。
答:首先確認(rèn)純化前的樣品中是否有目標(biāo)蛋白。
(1)有目標(biāo)蛋白,但大量穿透:
a、蛋白不含有標(biāo)簽或未能正確表達(dá)。
解決措施:Western Blot鑒定目標(biāo)蛋白是否有His-Tag。若沒有,需要重新構(gòu)建載體,添加組氨酸標(biāo)簽,并確認(rèn)標(biāo)簽正確表達(dá)。
b、蛋白折疊導(dǎo)致組氨酸標(biāo)簽未完全暴露。
解決措施:
在樣品和平衡緩沖緩沖液中加1-2M尿素,這樣蛋白結(jié)構(gòu)相對(duì)松散,也許能吸附而蛋白不會(huì)變性。
在變性條件下純化蛋白,加入4~8M尿素或4~6M鹽酸胍使蛋白變性。
如果蛋白有二硫鍵,最好加1-2mM DTT或1~5mM巰基乙醇(在樣品中添加),可以改善蛋白的吸附。
重新構(gòu)建載體,將組氨酸標(biāo)簽換到另外一端,或在組氨酸標(biāo)簽基因與目的基因之間增加一段Linker,可以降低蛋白折疊后標(biāo)簽被掩蓋的幾率。
c、標(biāo)簽太短。
解決措施:將標(biāo)簽的組氨酸數(shù)量增加至6-10個(gè)。
d、蛋白標(biāo)簽被水解。
解決措施:添加合適的蛋白酶抑制劑;盡量在低溫下處理樣品;對(duì)于分泌表達(dá)的蛋白,長(zhǎng)時(shí)間存放將增加蛋白被降解的風(fēng)險(xiǎn),應(yīng)盡快處理樣品。
e、蛋白溶解度偏低或聚集。
解決措施:在結(jié)合緩沖液中添加0.5%-1% Tween-20、Triton X-100,或5%~50%的甘油,可以增加蛋白的溶解度,減少蛋白聚集。
f、樣品及結(jié)合緩沖液不合適:解決措施:確認(rèn)樣品及緩沖液中不含有EDTA、還原劑等。另外,將樣品及結(jié)合緩沖液pH調(diào)節(jié)至7.4~8.5,有利于蛋白結(jié)合。
g、樣品及結(jié)合緩沖液中咪唑濃度太高:解決措施:降低樣品及結(jié)合緩沖液中的咪唑濃度。
(2)有目標(biāo)蛋白,但含量很低:
蛋白表達(dá)量低。解決措施:對(duì)樣品進(jìn)行濃縮,增加磁珠用量、延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間;優(yōu)化表達(dá)條件(誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間,培養(yǎng)基等);或更換其他合適的表達(dá)載體或表達(dá)系統(tǒng)。